流速对分离效果的影响较大，所以在洗脱分离蛋白质样品时保持合适而恒定的流速非常重要。凝胶色谱系统中洗脱流速主要取决于凝胶柱的内径和高度、凝胶种类、颗粒大小以及分离类型等。一般在开始正式洗脱之前，先要进行预备试验以确定合适的流速。较缓的流速可使蛋白样品与凝胶基质充分平衡，达到理想的分离效果，但是流速过低会造成样品在凝胶床内的横向扩散增大，使峰宽变宽，降低分辨率。此外，还延长了洗脱时间，降低工作效率。高流速易引起洗脱峰的重叠，使本来可分开的组分重合，而且会增大柱压，影响分离效果。一般凝胶的线性流速控制在2-10cm/h。商品凝胶出厂时，商家提供的一些流速参数可供使用者参考。在一般实验中通常用蠕动泵调节流速，没有条件的可通过控制一定的高度压差来控制流速。在实验中通常使用体积流速 （mL/min），有时为了实验需要，还需将体积流速转换成线性流速（cm/h）

加样体积 （Vs）也可对蛋白样品的分离效果造成较大的影响。体积过大，会造成平台洗脱峰或相邻峰的重叠，影响分离效果；加样过少，目的蛋白组分的收集量少、稀释倍数增大、浓度低，降低实验效率。
样品进样前应高度浓缩，但是浓度不可过大，否则会影响分离效果。蛋白质浓度应小于70mg/mL，一般在10-20mg/mL。必要时，需进行样品浓度系列试验，以确定zuijia值。过低的样品浓度可造成某一蛋白组分的过度稀释，影响收集；而浓度过高时会使流动相不稳定，造成洗脱峰的变形或重叠。此外，样品浓度还和分离纯化的类型有关，进行蛋白组别分离或脱盐除杂时，由于目的蛋白和杂质的分子量差异较大，故可适当提高样品浓度，而进行分子量差异较小的分级分离或分析性实验时，样品浓度尽量要低一些。
样品洗脱液中含有一定离子强度的盐溶液可防止蛋白质与蛋白质之间或蛋白质与凝胶介质之间的相互作用，排除蛋白质与流动相或与凝胶介质相互作用的干扰。一些不带电荷的中性蛋白在纯水中可实现有效分离，而在分离一些带电荷的蛋白质样品时特别要注意这一影响，一定要调整洗脱液的离子强度，排除离子吸附等干扰。例如，Tandex因含有羧基基团，呈弱酸性，所以在用该类凝胶进行色谱操作时常使用一定离子强度的盐溶液 （一般高于0.05）作为洗脱液，这样就可以避免Tandex与碱性蛋白发生吸附。在分离纯化蛋白质时一般使用20-100mmol/L NaCl作为盐溶液。但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积的变化。
由于在凝胶过滤色谱中所用的平衡液和洗脱液一致，故在整个操作中pH不发生变化，选用具有一定缓冲能力的缓冲液即可达到控制pH的目的。维持洗脱液一定的pH，一方面是考虑蛋白质样品的稳定性和溶解性，需尽量避开靠近蛋白样品等电点的pH范围，以防蛋白质沉淀。另一方面，平衡、洗脱中pH的变化会造成凝胶床体积的变化，影响分离纯化的效率和效果。所以在确定pH时要考虑蛋白质样品性质和凝胶所能耐受的pH范围这两方面的因素。pH一般控制在6-8，磷酸盐和Tris-HCl缓冲液的使用较多。生产商家提供的一些凝胶所适合使用的pH范围可供参考。
溶质的大小和分子量主要取决于分子形状，洗脱液中所溶解的蛋白质具有各种不同的分子形状 （如球蛋白、微不对称球蛋白、含纤维杆状蛋白和变性后的弯曲结构等），而在理想的凝胶过滤色谱中，蛋白质为球形分子，在柱内的保留时间仅与其分子大小和凝胶孔径大小之间的差别有关，所以不同形状的蛋白质分子对分离也有不同程度的影响。在测定一些非球形蛋白质分子量的实验过程中，通常在样品中加入高浓度的变性剂 （如8mol/L尿素），使各蛋白组分发生卷曲后，分子形状趋于一致。