离子交换色谱通常至少会使用两种不同的缓冲液：一种用于蛋白质上样并洗去不吸附的杂质，称为起始缓冲液；另一种用于洗脱吸附在柱上的蛋白质，称为洗脱缓冲液。

达到最终pH和盐浓度的洗脱缓冲液称为极限缓冲液。这里又分为两种情况，在完成吸附后将目的蛋白洗脱下来有两种方法：一种是通过改变pH，使蛋白质的带电状态发生变化而不能结合在交换剂上，此方法会用到两种不同pH的起始和洗脱缓冲液；另一种是通过增加离子强度，虽然不改变蛋白质的带电状况，但高的离子强度会降低蛋白质与离子交换剂之间的静电引力，从而将蛋白质洗脱下来，此方法会用到两种pH相同而离子强度不同的缓冲液，通常极限缓冲液是向起始缓冲液中添加特定浓度的盐类而形成。

为了保证目的蛋白在吸附阶段能结合到交换剂上，起始缓冲液的浓度一般比较低，介于0.01-0.05mol/L。但过低的起始浓度有可能造成蛋白质在离子交换剂上吸附过于牢固而给洗脱造成困难，同时也应当控制吸附阶段的时间。研究显示，将蛋白质吸附在离子交换柱上过夜再进行洗脱，比直接进行洗脱明显困难，这是由于长时间的吸附会引发蛋白质的构象缓慢发生改变，这种改变使之与交换剂结合更为牢固，并且这种构象变化一般都会造成蛋白质活性下降。合适的起始缓冲液浓度可以通过小样试验确定。

在采用改变pH的方法洗脱时，洗脱缓冲液的缓冲成分种类往往与起始缓冲液相同，只是控制比例关系不同造成最终pH不同。洗脱缓冲液在浓度方面并没有特殊的要求，常与起始缓冲液相同。在采用增加离子强度的方法洗脱时，所用洗脱缓冲液在缓冲物质种类、pH和浓度上往往都与起始缓冲液相同，通常是通过向起始缓冲液中添加特定浓度的其他种类盐 （如NaCl）来增加离子强度。

所以，实际上无论是何种缓冲液，缓冲物质的浓度通常都不大，为了使其具有足够的缓冲能力，必须满足一定的条件。