随着生物医药行业的不断发展，我国细胞与基因治疗领域研发与应用正加速崛起，高质量、高纯度的质粒DNA是细胞和基因治疗过程中的关键组成部分，质粒的纯度会严重影响到转染的效率，如果质粒不纯，其含有的杂质会严重影响转染复合体的形成。
如何提取高纯度的质粒DNA
质粒DNA基因治疗药物是以质粒DNA为载体的基因治疗产品，一般选择大肠杆菌作为宿主细胞，提取出的质粒中DNA会以多种形式出现：超螺旋质粒DNA (scDNA) 、开环DNA (ocDNA) 、线性DNA 和质粒DNA聚集体等。另外，还伴随有宿主蛋白 (HCP) 、宿主核酸 (HCD) 、RNA、内毒素等杂质。其中超螺旋质粒DNA（scDNA）是我们的目标产物，因为它的转染和表达效率最高，然而其他DNA杂质也有与scDNA非常相似的纯化特点，所以获得高纯度的质粒产物需要一个稳定有效的解决方案。
质粒纯化最好的方案是要有一个稳健有效的整体过程，其中每一步都能得到很好的优化。目前市场上应用比较更广泛的是经典的层析三步法，科诺赛生物对每一步层析工艺进行了优化，将不同原理的层析纯化技术、合适的层析介质结合在一起，进行了实验应用研究，可保证在高纯度的基础上，工艺更加的稳定及高效。
超螺旋质粒DNA纯化三步法：
第1步 捕获质粒DNA，去除RNA
（凝胶过滤层析 Chromrose 6FF）
第2步 去除ocDNA
（亲和层析 Plasmid Chromrose HP）
第3步 去除痕量杂质及内毒素
（离子交换层析 MoSphere 50M Q）
质粒DNA纯化方案及案例解析
第一步 凝胶过滤层析纯化：捕获质粒DNA，去除RNA
使用Chromrose 6FF凝胶过滤层析介质进行第一步纯化，主要去除大量RNA和宿主蛋白等小分子杂质,根据分子大小的不同对不同的组群进行分离，由于质粒DNA和RNA的分子量差异很大，因此上样量可以达到0.3CV，在纯化时可同步进行缓冲液置换，直接与第二步亲和层析纯化进行无缝对接。
实验条件
样品：浓缩20×澄清碱性裂解液
层析柱：HiQumn CTN 30
层析介质：Chromrose 6FF
上样量：0.3CV
缓冲液：2.1 M (NH4)2SO4，10 mM EDTA， 100 mM Tris-HCl，pH 7.5
凝胶过滤层析纯化结果：Chromrose 6FF 回收率≥95%，电泳结果显示样品去除RNA≥95%。
第二步 嗜硫亲和层析纯化：去除开环质粒(ocDNA)
使用Plasmid Chromrose HP嗜硫亲和层析介质进行第二步纯化，ocDNA和scDNA分子性质高度相似，其中scDNA具有更高的碱基暴露程度和表面电荷，Plasmid Chromrose? HP嗜硫亲和介质利用本身的特性可以特异性得将ocDNA和scDNA分开，提高质粒的均一性。经过这两步层析纯化后，scDNA的纯度可以提高到90%以上。
实验条件
样品：Chromrose 6FF后的质粒DNA
层析柱：HiQumn CTN 30
层析介质：Plasmid Chromrose HP
平衡缓冲液：2.0M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
洗脱缓冲液：0.3M NaCl，1.7 M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
注意：不同序列及大小的质粒，纯化时缓冲液及载量要适当调整。
亲和层析纯化结果：Plasmid Chromrose HP 回收率可达90%，电泳结果显示可实现对ocDNA和scDNA的完全分离，可获得纯度≥95%的scDNA。
第三步 离子交换层析纯化：去除痕量杂质及内毒素
使用MoSphere 50M Q 阴离子交换层析介质进行第三步精纯，去除痕量杂质和内毒素。经过前两步层析纯化后，scDNA纯度和均一性基本满足了生产需求，但依然存在内毒素的隐患，此步骤主要是利用内毒素在高盐条件下不与介质结合的原理，除去样品中的内毒素，PolyGel 30Q的对本样品质粒收率有85%。
实验条件
样品：Plasmid Chromrose HP后的质粒DNA
层析柱：HiQumn CTN 30
层析介质：MoSphere 50M Q
平衡缓冲液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
洗脱缓冲液：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5
离子交换层析纯化结果： MoSphere 50M Q 对样品的回收率约为83%，内毒素含量1.2EU/mg(scDNA)
总结：
科诺赛生物的质粒纯化三步法被证实是稳健有效的方案，实用性强。随着工艺的不断发展，我们也会不断的去优化工艺、升级产品，帮助客户提高生产效率，降低生产成本，切实地为国内的细胞与基因治疗出一份力。