多肽纯化大揭秘：层析介质如何选？
在生物医药领域，多肽药物的光芒愈发耀眼。自从胰岛素治疗问世，多肽疗法便在医学舞台崭露头角。随着2010年首例基于多肽疗法的肿瘤疫苗Sipuleucel-T被美国FDA批准上市，越来越多的药企开始致力于多肽药物的研发。多肽药物具有分子量小、特异性高、免疫原性低等优点，因此被广泛应用于各种疾病的诊断和治疗中，如哮喘、过敏、癌症、传染病和自身免疫性疾病等。
探秘多肽：结构与合成中的科学奥秘 由三个或三个以上氨基酸分子组成的肽叫多肽，分子量一般小于10,000 Da。多肽种类繁多，功能复杂，常见的有免疫活性肽、神经活性肽、抗菌性活性肽等。通常来源于天然植物、动物、微生物发酵或外源表达，一般没有三维空间结构，耐受有机相。
Figure 1.氨基酸、多肽和蛋⽩质的关系
Figure 2.多肽的分子结构示例
多肽的合成主要有三种方式，天然提取、生物合成和化学合成。早期，多肽主要由动物脏器获取。例如，通过震荡分离技术从小牛胸腺中提取胸腺肽，制成胸腺肽针剂用于人体免疫。但天然提取的多肽因含量低、易产生排异反应等缺点无法进行工业放大生产。
生物合成和化学合成是目前主流的多肽合成方式。
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生物合成法
基因工程法
酶解法
利用蛋白酶或肽酶水解天然蛋白质，获得小分子活性肽。产物保留天然结构，但产量低，污染风险较高。
微生物发酵法
通过筛选高产菌株，以廉价碳源为底物合成多肽，兼具绿色环保和规模化生产的潜力。
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化学合成法
固相合成法(SPPS)
液相合成法(LPPS)
在溶液中直接进行氨基酸合成，适合短肽(<10个氨基酸)的合成，但需频繁纯化中间体，操作复杂。
多肽纯化大揭秘：不同合成产物的专属方案
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化学合成法
Figure 3. 化学合成多肽纯化⽅案
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生物合成法
生物合成法适合序列较长或结构较复杂的多肽，通常采用大肠杆菌/酵母/CHO细胞表达重组多肽，经捕获、酶切或中度纯化、精纯等步骤获得高纯多肽。
不同的表达体系和融合表达策略采用不同的纯化方案。
1、⼤肠杆菌表达带His标签多肽
大肠杆菌表达的蛋白质通常为包涵体，也有周质空间可溶表达方式。对于包涵体表达，需要加高浓度尿素或盐酸胍和还原剂以溶解包涵体，推荐使用三（羧甲基）乙二胺（TED）螯合的Ni填料进行His标签蛋白的捕获。后续经酶切、IEX和RPC层析后获得高纯度的多肽产品。
Figure 4. 大肠杆菌表达带His标签多肽纯化方案
2、⼤肠杆菌表达不带His标签多肽/酵母表达多肽
对于大肠杆菌表达的不带His标签的多肽前体或酵母表达的多肽前体，可以使用离子交换层析捕获，经酶切、IEX和RPC层析后获得高纯度的多肽产品。
Figure 5. ⼤肠杆菌表达不带His标签多肽或酵⺟表达多肽纯化⽅案
选对层析介质，多肽纯化不再难！科诺赛产品来助力
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离子交换层析介质
科诺赛研发生产的PolyGel系列高分辨率离子交换层析填料，专为包括多肽在内的复杂生物分子的中度及精细纯化而设计，采用聚合物PS-DVB为基质，提供15 μm、30 μm、35μm、50 μm四种粒径规格。15 μm、30 μm采用单分散聚苯乙烯微球，粒径分布均一，其高度交联的特性使填料更耐压，而35 μm、50 μm则对孔径进行优化，结合载量更高。
PolyGel系列产品是经过基质表面亲水改性后再键合离子交换基团制备而成，包含强阳离子交换(S/SP)、强阴离子交换(Q)、弱阴离子交换(DEAE)，具有良好的亲水性，非特异性吸附低，机械强度高，不仅能够在复杂的环境下保持性能的稳定性，还具备良好的可放大性。
较为常用的有PolyGel 15S、PolyGel 15Q、PolyGel 30S 、PolyGel 30Q、PolyGel 35S、PolyGel 35Q。
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亲和层析介质
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反相层析介质
此系列产品提供15 μm、30 μm、35 μm等不同粒径的选择，以满足包括多肽在内的不同纯化领域和阶段的需求。其中，15 μm和30 μm采用单分散聚苯乙烯微球，粒径分布均一，其高度交联的特性增强了填料的耐压性，且批间差异极小，质量稳定，适合工业化生产。35 μm产品通过优化孔径结构带来更大的比表面积和更高的结合载量，确保低背压和高流速，实现高效生产。散装填料搭配多种空柱，适用于不同规模的工艺放大。
多肽的紫外吸收通常在206-220 nm。如果含有芳香族的基团，紫外吸收最大值会在268-280 nm。
想要获取选择性和稳定性更好的多肽，可以将离子交换、亲和、反相层析等多种技术结合使用。
参考文献
1.Yang, Z.Y., Cui, Z.Y. and Zhang, W.G. Isolation, purification and identification of antibacterial peptides from Jinhua ham broth and molecular simulation analyses of their interaction with bacterial porins. Food Chemistry 473 (2025). https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.143026
2、Wu, Y., He, H. and Hou, T. (2021), Purification, identification, and computational analysis of xanthine oxidase inhibitory peptides from kidney bean. Journal of Food Science, 86: 1081-1088. https://doi.org/10.1111/1750-3841.15603
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