解锁小核酸纯化密码：科诺赛为生物制药赋能
在生物制药的赛道上，小核酸药物正以迅猛之势崛起，成为继小分子药和抗体药后的璀璨新星。它广泛应用于神经系统疾病、遗传性疾病和代谢性疾病等诊疗领域，凭借精准调控致病基因表达的独特能力，为无数患者带来新的希望。今天，我们就深入探索小核酸纯化的奥秘，看看科诺赛如何凭借专业技术助力行业发展。
核苷酸是构成核酸（DNA和RNA）的基本单元，参与遗传信息的存储、复制和表达，并在能量代谢中起重要作用（如ATP的合成和分解）。每个核苷酸由一个磷酸基团、一个五碳糖（核糖或脱氧核糖）以及一个含氮碱基（腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C、胸腺嘧啶T或尿嘧啶U）组成。
Figure 1. 两种核苷酸的分⼦结构
寡核苷酸是由多个（通常约2至50个）核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的短链核酸片段，可以是单链或双链。具有多种生物学功能，包括基因表达的调控、基因敲除、PCR扩增引物等。
小核酸通常指那些具有特定功能的短链核酸分子，如小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和反义寡核苷酸（ASO）等。siRNA通过触发RNA干扰途径（如降解靶基因mRNA）下调基因表达。miRNA通过与靶mRNA的互补配对，结合RNA诱导沉默复合体（RISC），抑制翻译或促进靶mRNA降解。反义寡核苷酸通过与靶mRNA结合调节基因表达或改变剪接事件。
Figure 2. siRNA和miRNA作⽤机制
Figure 3. ASO作⽤机制
小核酸由于高度依赖碱基互补配对原则，作用于基因转录和翻译过程，因此可以从根源上调控致病基因的表达，并可达到单碱基水平上的特异型，同时可以解决某些疾病的蛋白靶点难以成药的问题。
与传统的小分子药和抗体药相比，小核酸药物制备工艺相对简单、特异性强、治疗效率高、作用时间长、毒性低，在疾病诊断和治疗领域具有广阔的开发潜力和应用价值。
小核酸制备工艺与多肽类似，可采用固相合成法，经过多个循环的脱保护、偶联、氧化、加帽得到目标分子。但在合成过程中会产生多种不同的杂质，如缺失或增加序列的寡核苷酸、未完全去保护基团的产物、缺失嘌呤碱基的寡核苷酸以及其他降解产物。
可以利用小核酸药物分子和杂质分子之间的差异进行分离纯化，如磷酸基团、DMT基团、硫代或甲基化等特性。
Figure 4. ⼩核酸纯化策略与层析介质选择
阴离子交换层析（AIEX）是目前最为成熟的小核酸纯化的首选，适用于90%寡核苷酸的纯化，特别是已脱去DMT保护基团（DMT-off）的寡核苷酸。科诺赛有以下四款层析介质可选择：
•Crysto Q（90 μm）
•Crysto Q 40（40 μm）
•PolyGel 30Q（30 μm)
•PolyGel 15Q（15 μm)
粒径越小，分辨率越高，但相应地背压也越高，对设备的要求越高。如果Crysto Q 40的分离效果可以达到PolyGel 30Q的水平，同时又能保证收率和纯度达到90%以上，那就不需要用到中高压的设备和层析柱，背压低，成本低。
对于携带DMT基团（DMT-on）的寡核苷酸，通常进行两步层析，第一步疏水（HIC）或反相（RPC），第二步脱DMT后衔接IEX精纯。
优先选择疏水层析，适用于链比较长的寡核苷酸（一般>30 mer）、全硫代寡核苷酸以及其他难分离的寡核苷酸。
科诺赛的Phenyl Chromrose 6FF和Butyl Chromrose 4FF疏水层析介质以高流速的琼脂糖凝胶为基质，以Phenyl和Butyl为配基，保留了天然多糖化合物极好的亲水性及孔结构，对生物活性大分子具有很好的相容性，疏水性强，载量高，特别适用于核酸的纯化。
而Phenyl MoSphere 50M和Butyl MoSphere 50M以亲水性聚甲基丙烯酸酯（PMMA）为基质，与琼脂糖基质疏水填料相比，耐压性更强、孔径更大，在高流速下能保持较高结合载量，可满足工业级应用。
反相层析适用于长链的核酸、脂类修饰的寡核苷酸以及离子交换纯化效果不好的寡核苷酸。
传统的C18反相色谱柱载量低，因而需要较大体积的填料或者较多的循环次数，而科诺赛的Poly系列聚合物反相层析填料弥补了这一缺陷，且在耐碱性、填料寿命与避免碱性化合物拖尾方面具有显著优势，同时又具备高机械强度、高通量和高分辨率。
但有机溶剂的使用通常意味着较高的处理成本，因此反相层析一般作为小核酸纯化的最后选择。
参考⽂献
1.K.Kobl,L.Nicoud,E.Nicoud,A.Watson,J.Andrews,E.A.Wilkinson,M.Shahid,C.Mckay,B.I.Andrews,B.A.Omer, O.Narducci, E.Masson, S.H.Davies,T.Vandermeersch, Oligonucleotide Purification by IonExchange Chromatography: A Step-by-Step Guide toProcess Understanding, Modeling and Simulation,Organic Process Research & Development 28 (7),2569-2589 (2024). DOI: 10.1021/acs.oprd.4c00013
