质粒纯化技术漫谈（一）：MegaGel 50V DEAE超大孔阴离子交换层析填料

时间：2025-10-29 14:36:24 点击数：

质粒提取是分子生物学实验的“基本功”，但也是最容易“翻车”的环节之⼀。你是否也曾被这些问题困扰：酚氯抽提操作繁琐、试剂毒性大、重复性差？普通试剂盒结合容量有限、得率低、内毒素去除效果不理想？纯化效果不稳定，严重影响下游细胞转染、动物实验等高级应用？这些问题的核心，往往在于纯化介质的选择。今天，我们将聚焦于科诺赛超大孔阴离子交换层析介质MegaGel 50V DEAE，看它如何助你轻松实现转染级质粒的高效获取。

什么是质粒

质粒是存在于细菌、酵母等细胞中，独立于染色体DNA以外的、能进行自我复制的双链、环状DNA分子（极少数为线性）。它通常不携带生命活动所必需的基因，但对宿主在某些特定环境下的生存可能具有优势。

质粒的分子量从1 kb至超过400 kb不等，实验室常用的克隆载体通常较小，在3-10 kb左右。较小的质粒更易于被导入宿主细胞，复制拷贝数也相对更高、更稳定，可以实现更高的转染效率。

超螺旋形态（scDNA）是在DNA双螺旋基础上再次螺旋化，使质粒分子结构紧凑致密，是质粒最典型、最稳定的形态。该形态下质粒活性最高，转染效率和基因表达能力最优。如果一条链发生断裂，超螺旋结构解除，分子松弛成环状，则形成开环形态（ocDNA），转染效率降低约30%。如果两条链在同一处或相近处断裂，则形成线性分子（L-DNA）。这三种构象在琼脂糖凝胶电泳中迁移速率不同（超螺旋〉线性〉开环），因此在电泳图上我们常常能看到多条带，这有助于判断质粒的完整性和纯度。

Figure 1：质粒DNA的三种分⼦构型

纯化策略与原理

碱裂解：质粒与所有DNA一样，是由脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的长链大分子，因此对强酸、强碱、高温和高能量辐射敏感。在温和的碱性条件（pH>12）下，染色体DNA会完全变性解开，而共价闭合环状的质粒DNA仅部分变性，当恢复中性pH时，质粒能迅速复性并溶解在上清中，而染色体DNA则与蛋白质、细胞碎片等形成不可溶的白色絮状沉淀。这是质粒提取的关键步骤。

阴离子交换层析：利用质粒和宿主细胞核酸、宿主细胞蛋白、内毒素等带电性质的差异去除以上杂质。科诺赛MegaGel 50V DEAE阴离子交换层析介质，以聚合物PS-DVB（聚苯乙烯-二乙烯基苯）为基质，搭配3000 Å开放型超大孔结构设计，可以让质粒等大尺寸生物分子进入孔道内部进行交换结合，同步实现高载量、高流速和高回收率的分离纯化。

应用案例

1、实验材料

2、实验方法

2.1 质粒提取（碱裂解法）

1）菌液4℃、12000 xg离心10 min，去上清。

2）每1 mL菌液所得沉淀加入100-250 μL重悬液，充分涡旋重悬菌体。

3）加入与重悬液等体积的裂解液，温和颠倒混匀5次，使菌液变得清亮黏稠。室温裂解不超过5 min。

4）根据预实验结果加入适量预冷中和液终止反应，使pH恢复至中性（理想pH 7.0-7.5）。温和颠倒混匀10次，可见白色絮状沉淀（含变性的染色体DNA、蛋白质、SDS-钾复合物等），冰上放置5 min使沉淀完全。

5）4℃、12000 xg离心10 min，收集上清，0.45 μm过滤。测pH和电导率，调整pH至8.0左右，用阴离子平衡液A稀释至电导率<6 mS/cm。测A260浓度，记为Loading。

2.2 阴离子交换层析

1）按照保留时间3-5 min进行上样。

2）线性梯度洗脱（0-100%B，20 CV），按峰收集流穿样AEX-FT和洗脱样AEX-E，测A260浓度。

2.3 后续处理

1）1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度。

2）目标组分用100 kDa超滤管浓缩换液至TE Buffer。

3、实验结果

Table 1：纯化各组分检测结果

备注：质粒DNA浓度（μg/mL）=A260 x 50 x 稀释倍数。A260/A280在1.8-2.0之间表示蛋白质与RNA污染较少，比值过高可能提示RNA污染，比值过低提示蛋白质污染。纯净DNA样本的A260/A230比值应>2.0，若比值偏低，可能表明存在有机溶剂（e.g. 酚、氯仿）、盐离子（e.g. 胍盐、硫氰酸胍、EDTA）或碳水化合物等杂质。

Figure 2：质粒纯化MegaGel 50V DEAE阴离⼦交换层析图谱

Figure 3：质粒纯化各组分琼脂糖凝胶电泳图谱

流穿样AEX-FT有明显的A260/A280紫外吸收，但琼脂糖凝胶电泳中无条带，表明该组分中的主要成分是能被紫外波长检测到、但分子量太小或结构上无法在凝胶中形成清晰条带的物质，可能包含降解的基因组DNA片段、RNA片段、游离的核苷酸和碱基、蛋白质等。
洗脱样AEX-E1/E2/E3在凝胶底部前沿形成一片模糊的条带或云状拖尾，表示样品中存在未被RNA酶充分降解的RNA，可能的原因有RNA酶失活失效、用量不足或菌株的培养条件中含有RNA酶抑制剂。
AEX-E4为成功捕获的质粒DNA。若需进一步分离scDNA和ocDNA异构体，获取更高纯度的质粒，可以在阴离子交换层析之后增加一步疏水或亲和层析。
MegaGel 50V DEAE阴离子交换层析可有效去除质粒提取液中的宿主细胞蛋白、宿主细胞RNA、宿主基因组DNA、内毒素等杂质，实现质粒DNA的高效捕获和纯化。不仅可以用来纯化常规用于酶切、克隆和PCR的质粒，还可以应用于细胞转染、动物实验及临床研究等需严格控制内毒素含量的质粒提取。

注意事项

1、质粒对核酸酶敏感，易被DNA酶降解，表达纯化过程中需避免相应酶类的使用。

2、剧烈的移液或涡旋会产生强大的机械剪切力，可将大分子质粒从超螺旋打断至开环或线性或碎片状态，因此操作质粒DNA时需要轻柔。

3、碱裂解溶液需新鲜配制，若保存不当或放置时间过长，NaOH可能吸收空气中的CO₂生成碳酸钠，导致碱性下降，影响裂解效果。裂解时间不宜过长（不超过5 min）。

4、中和后若pH偏离中性，可能导致质粒复性不佳、杂质沉淀不完全等。强酸性条件下，质粒DNA可能发生不可逆的变性或降解。若混合后pH偏低，可缓慢滴加稀NaOH溶液（e.g.1M NaOH）回调pH。有效的中和反应后会形成大量白色絮状沉淀，若沉淀量稀少或上清液严重混浊，通常意味着反应不完全，质粒提取物的纯度可能较差。最好先通过预实验初步估算需要加入的中和液比例，再根据实际pH检测结果实时调整。

5、纯化前最好使用足量并且活性良好的RNA酶特异性降解RNA，否则可能干扰紫外定量，导致测得的质粒DNA浓度虚高；还会影响如酶切、转化、转染、测序等下游实验的反应效率和准确性；RNA还可能与DNA结合，增加纯化难度。

结语